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工程发夹提高了CRISPR准确度

文章作者:www.cs-vaccine.com发布时间:2020-03-18浏览次数:1680

杜克大学的生物医学工程师开发出一种方法,可以将CRISPR基因组编辑技术的准确性平均提高50倍。他们相信它可以很容易地转换为任何编辑技术的不断扩展的格式。

该方法在指导RNA上添加了短尾,用于鉴定DNA序列以进行编辑。这种添加的尾部向后折叠并与自身结合,形成“锁定”,只能通过靶DNA序列除去。

该研究于4月15日在线发表在Nature Biotechnology上。

“Crisp通常具有令人难以置信的准确性,但有一些脱靶活动的例子对提高整个领域的特异性具有广泛的兴趣,”杜克大学鲁尼家族生物医学工程副教授Charles Gersbach说。 “但到目前为止提出的解决方案不能在不同的CRISPR系统之间轻松转换。”

CRISPR/Cas9是细菌用于靶向和切割入侵DNA的防御系统。虽然第一个为人类细胞设计的CRISPR技术来源于一种叫做化脓性链球菌的细菌,但更多的细菌种类也有其他形式。

该领域的科学家花了数年时间寻找具有所需特征的新CRISPR系统,并不断添加到CRISPR文库中。例如,一些系统较小并且更适合于病毒载体的内部,用于递送至人细胞用于基因治疗。但无论他们的个人能力如何,每个人都有一个不必要的遗传编辑器。

CRISPR系统的共同特征是它们使用RNA分子作为指导,其位于基因组中的靶DNA序列上。一旦指导RNA找到其互补的基因序列,Cas9酶就像剪刀一样在DNA中切割,促进基因组序列的变化。但是因为每个归巢序列只有20个核苷酸长,并且人类基因组含有大约30亿个碱基对,所以需要许多种类,并且CRISPR有时会有错误,并且序列中缺少一个或两个碱基对。完善。

提高CRISPR准确度的一种方法是需要两个Cas9分子结合相同DNA序列的相对侧以完全切割。虽然这种方法有效,但它会给系统增加更多组件,增加其复杂性并使其更难以交付。

另一种方法是对Cas9蛋白进行基因工程改造,使其不那么精力充沛,因此不太可能跳跃并犯错误。虽然这也显示出有希望的结果,但是这种类型的蛋白质工程是费力的,并且这种努力对于每个CRISPR系统是特异性的。

“似乎几乎每个星期都会发现一种新的CRISPR系统,它具有独特的性质,使其对特定应用非常有用,”Gersbach说。 “每当我们发现新的CRISPR蛋白质以使其更准确时,广泛的重新设计并不是一个简单的解决方案。”

“我们专注于不添加更多组分的解决方案,并且对于任何类型的CRISPR系统都是常见的,”Dewran Kocak博士说。 Gersbach实验室的学生负责该项目。 “所有CRISPR系统的共性都是指导RNA,这更容易设计。”

Gersbach和Kocak的解决方案是将指导RNA延伸多达20个核苷酸,将其折叠回自身并结合到原始指导RNA的末端以形成发夹形状。如果在仔细检查潜在切割的DNA序列中单个碱基对是不正确的,则产生非常难以替换的锁定。但是因为指导RNA更喜欢与DNA而不是自身结合,DNA的正确组合仍然可以打破锁定。

“我们能够微调锁的强度,以指导RNA在正确匹配时正常工作,”Kocak说。

在本文中,Kocak和Gersbach表明,这种方法可以将来自四种不同细菌菌株的五种不同CRISPR系统的人类细胞裂解的准确性平均提高50倍。在一个案例中,改善上升到200多次。

“这是一个非常简单的想法,尽管Dewran已经完成了几年的研究,表明它的工作方式与我们认为的方式相同,”Gersbach说。 “这是一个很好的,优雅的解决方案,可以摆脱脱靶活动。”

展望未来,研究人员希望看到在这种方法中可以使用多少种不同的CRISPR变体变体,并提供完整的洞察机制,了解锁定机制如何工作以查看CRISPR变体之间是否存在差异。由于这些实验是在培养的细胞中进行的,研究人员迫切希望看到这种方法如何提高真实动物疾病模型中CRISPR的准确性。